作者：上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科 孟祥超
椎间盘是脊椎动物全身最大的无血管组织之一。髓核处于椎间盘最内部，为高度含水且富含蛋白聚糖的组织结构。缺氧诱导因子(HIF)-1α在髓核细胞中表达明显，条件性敲除小鼠髓核细胞HIF-1α基因后，小鼠髓核细胞出现大量死亡，椎间盘发生明显退变，表明HIF-1α与椎间盘退变密切相关，但目前其机制仍不明确。
椎间盘结构及退变性疾病
椎间盘为无血供组织，由髓核、上下终板及外围纤维环共同构成，营养供应主要有终板途径和纤维环途径。髓核来源于脊索分化，早期呈胶冻样，而纤维环和上下终板起源于生骨节。随着机体老化，软骨终板逐渐钙化，氧气等营养物质供应及代谢废物排除受阻，椎间盘内的缺氧微环境逐渐加剧，加上压力、炎症因子等因素，椎间盘细胞数量及细胞外基质逐渐减少，纤维环结构改变，最终引起一系列脊柱退变性疾病。
椎间盘退变是椎间盘突出的基础，为引起颈肩及腰背痛最常见的原因，严重时可导致滑脱、椎管狭窄等。目前对于症状较轻的椎间盘退变性疾病多采用药物、封闭治疗等非手术疗法，主要目的是镇痛，而对严重的椎间盘退变性疾病多采用手术疗法松解压迫、稳定退变节段椎体序列。采取单一髓核摘除术治疗严重椎间盘退变性疾病常面临疾病复发的可能，而采取椎体融合内固定又会引起相邻节段退变加速。采用生物疗法促进椎间盘细胞修复与再生或延缓椎间盘退变进程，已逐渐成为研究热点，但其相关机制仍处于探索中。
HIF分类及功能
HIF是在基因转录水平调节细胞缺氧反应最主要的调节因子，包括HIF-1、HIF-2、HIF-3。目前认为HIF-1在机体组织中广泛表达，在低氧的组织环境中起主要作用，它能与下游多个靶基因相互作用，在改善组织缺血、缺氧等方面有重要作用。
HIF-1以异二聚体的形式存在，由α亚基和持续表达的β亚基组成，β亚基又被称为芳香烃受体核转运子（ARNT）。α亚基的结构域包含1个独特的氧依赖降解结构域(正常氧分压下HIF-1降解所必需的结构)和2个反式激活结构域(主要参与转录激活作用)。HIF-1通过2个亚基的寡聚及与目标基因增强子（低氧反应元件）结合反式激活HIF-1靶基因。HIF-1的活性主要由HIF-1α决定，可调控血管内皮生长因子、糖酵解酶葡萄糖转运体-1、促红细胞生成素等一系列缺氧诱导基因的表达，促进细胞适应低氧环境。
HIF-1α在髓核中的生物学功能
在髓核细胞中的表达与降解
Lin等分析突出腰椎间盘样本中HIF-1α的基因多态性，发现1790A>G的单核苷酸多态性（SNP）可明显影响HIF-1α和VEGF的表达，认为HIF-1α基因的1790A>GSNP有可能成为鉴定腰椎间盘突出敏感性和严重程度的分子标记。Risbud等研究发现，鼠、人和羊的髓核细胞在低氧条件下持续表达HIF-1α。Richardson等检测椎间盘正常和退变人群椎间盘HIF-1α的表达，发现仅髓核细胞表达HIF-1α。髓核细胞及其分泌的蛋白多糖、Ⅱ型胶原纤维等细胞外基质是维持椎间盘高度、正常功能及延缓椎间盘退变发生的重要成分。有观点认为髓核细胞全部来源于脊索细胞，而另一种观点认为类脊索细胞在出生后即开始发生凋亡，最后髓核细胞由非脊索来源的细胞所代替。由于表达HIF-1α是髓核细胞的重要特征，根据有无HIF-1α表达可鉴别髓核细胞与内层纤维环细胞。Risbud等建议将HIF-1α作髓核细胞表面标记之一，它可用于髓核细胞鉴定及纯化。
脯氨酸羟化酶（PHD）是依赖双加氧酶的超家族蛋白，包括PHD1、PHD2、PHD3。HIF-1α在常氧状态下主要依靠PHD2介导的泛素化途径降解。在常氧条件下，缺氧诱导因子抑制因子(FIH)-1通过FIH-1-Mint3轴影响HIF-1α与转录共激活因子p300/CBP的结合，进而抑制HIF-1α的转录活性，减少HIF-1α的表达。
以往认为，在低氧环境中髓核细胞PHD2失去活性，功能完全被抑制，从而使HIF-1α稳定存在，并转入细胞核内与ARNT、p300等结合，进而调控某些基因表达。但目前有研究认为，即使在低氧环境中，部分PHD酶活性仍被保留，但由PHD2介导的降解途径不再起主要作用，只起选择性局部降解的作用；髓核细胞中FIH-1-Mint3轴不能明显抑制HIF-1α的转录活性。此时，HIF-1α的降解主要是由hsp70介导的26S蛋白酶体途径和经自噬的溶酶体酶途径完成，且与氧张力无关。
由于HIF-1α在髓核细胞中持续表达，降解作用相对较弱，且M2型丙酮酸激酶（PKM2）-PHD3复合物等可加强HIF-1α与p300的相互作用，因此PHD3可增强HIF-1α的转录活性等，使HIF-1α在细胞内稳定存在，调控相关基因表达。
对髓核细胞代谢与凋亡的调控
对髓核细胞细胞代谢的调控
HIF-1能调节葡萄糖和线粒体能量代谢，如增加无氧糖酵解的葡萄糖转运蛋白（GLUT）及调控能量合成的关键酶，在维持髓核细胞代谢活动中起重要作用。GLUT是一种膜构成蛋白，在细胞膜表面顺浓度梯度转运葡萄糖，在低氧环境中髓核细胞的能量代谢几乎完全依靠无氧糖酵解。Richardson等研究正常和退变椎间盘中的GLUT-1、GLUT-3、GLUT-9和HIF-1α表达，结果发现这4种蛋白在正常和退变椎间盘中均表达，HIF-1α在退变的椎间盘的表达高于正常椎间盘；在低氧条件下椎间盘中的HIF-1α主要通过调控GLUT-1、GLUT-3、GLUT-9的表达来维持髓核细胞代谢活动。
磷酸甘油酸激酶（PGK）-1是二磷酸腺苷（ADP）转化为三磷酸腺苷（ATP）的关键酶，HIF-1α可调节PGK-1的表达来调控髓核细胞能量代谢，体内敲除髓核细胞HIF-1α后PGK-1mRNA水平明显下降，髓核细胞发生大量死亡。
促进退变椎间盘髓核细胞存活
退变椎间盘的微环境以低氧为特征，体外实验证实髓核细胞可在低氧环境中生存且细胞活力保持不变。因此，髓核细胞可能产生某些机制使椎间盘细胞在低氧环境中存活。半乳糖凝集素（Gal）-3能抑制Fas配体介导的鼠腰椎间盘髓核细胞凋亡。Zeng等研究大鼠髓核细胞中HIF-1α与Gal-3启动子之间的关系，发现HIF-1α可与Gal-3低氧反应元件相结合，诱导Gal-3表达并抑制Fas/Fas配体介导的髓核细胞凋亡。Fujita等研究发现，髓核细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）-A和mbVEGFR-1(一种跨膜的血管内皮生长因子受体)，两者结合可引起髓核细胞凋亡。Agrawal等研究发现，在低氧条件下HIF-1α和HIF-2α可调节p300的结合蛋白cited2启动子活性及其表达，cited2过表达可抑制VEGF在髓核细胞的表达。因此，HIF-1α和HIF-2α可能通过间接调节VEGF表达抑制髓核细胞凋亡，加强髓核细胞在特殊微环境中的存活。
Merceron等条件性敲除小鼠髓核细胞HIF-1α基因，经组织学观察发现小鼠髓核细胞自出生至1个月后出现大量死亡，髓核被其他非脊索来源的组织所代替，且脊柱生物力学也发生退变性改变。因此，HIF-1α可能具有抑制髓核细胞凋亡或维持细胞存活的作用。但也有学者的研究结果与之相反，他们认为严重缺氧及高表达HIF-1α可能促使髓核细胞凋亡。Moritz等研究证实，HIF-1α可使细胞适应一定程度的低氧刺激，如果这种刺激超过一定程度，它也会诱导细胞发生凋亡。
Ha等研究腰椎间盘突出症患者椎间盘组织中HIF-1α的表达，发现均存在不同程度的细胞凋亡，纤维环未破裂型突出组中细胞凋亡明显，纤维环破裂型突出组中HIF-1α表达及细胞凋亡数最多，结果表明HIF-1α高表达与细胞凋亡呈高度正相关，但认为HIF-1α高表达虽然促使部分细胞凋亡，但可能有助于维持椎间盘的内稳态。
对椎间盘基质的调控
对髓核细胞细胞外基质合成的调节
椎间盘细胞外基质主要由蛋白聚糖类和胶原类物质组成，胶原类物质构成网络结构，将蛋白聚糖类物质包裹其中，蛋白聚糖类物质含水能力非常强，起维持髓核凝胶状性质和吸收椎间盘压力负荷的作用。椎间盘细胞占整个椎间盘组织的比例很小，却起维持椎间盘细胞外基质动态平衡的作用。
Agrawal等报道，HIF-1α可直接诱导蛋白聚糖mRNA和蛋白质合成，且可能通过间接加强硫酸化反应增加蛋白聚糖合成。Richardson等报道，HIF-1α可调节GLUT数量，促进髓核细胞摄取葡萄糖，有助于糖胺聚糖合成。在体内条件性敲除小鼠髓核细胞HIF-1α后，髓核细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和VEGF表达减少，椎间盘细胞数量减少，表明HIF-1α可增加蛋白聚糖合成，维持椎间盘特性。但也有学者认为HIF-1α可抑制糖胺聚糖的合成。
Tran等研究发现，在髓核细胞中的炎性因子可使钙调蛋白（CNN）2增加，而抑制HIF-1α可使蛋白聚糖、Ⅱ型胶原合成增加。葡萄糖醛酸转移酶（GlcAT）-1是硫酸软骨素硫酸盐（糖胺聚糖的主要成分）的合成限速酶。Gogate等研究髓核细胞中HIF-1α和HIF-2α对GlcAT-1启动子活性的影响，发现HIF-1α和HIF-2α通过与一种或多种缺氧反应元件相互作用抑制GlcAT-1启动子的活性，因此认为HIF-1α可能抑制糖胺聚糖合成。研究发现，低氧环境中髓核细胞HIF-1α升高，可促进多配体蛋白聚糖（SDC）-4表达增加，SDC-4可与含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）结合加速降解蛋白聚糖，而SDC-4又可抑制转录因子SOX-9表达，间接减少Ⅱ型胶原生成，导致椎间盘基质减少。
对髓核细胞营养不良性钙化作用的调控
在正常机体中，钙化只限于在坚硬组织中，构成骨骼和牙齿。由于年龄、创伤、疾病等原因，软组织中也可能出现营养不良性钙化，导致疾病发生发展，如关节软骨钙化导致骨关节炎。正常椎间盘内存有纤维蛋白和含水分的细胞外基质，但却无钙化沉着物，髓核细胞中局部调控钙盐对预防椎间盘营养不良性钙化起重要作用。
ANK可控制焦磷酸盐转运，继而调节钙化盐沉积，而无机焦磷酸盐是营养不良性钙化的抑制物。大量实验表明，ANK突变可导致关节和骨的不正常钙化。Skubutyte等研究成熟大鼠和出生大鼠髓核中ANK的表达和定位，发现在沉默HIF-1α和HIF-2α后ANK启动子活性增加；过表达HIF-1α和HIF-2α可抑制ANK启动子活性，认为HIF-1α和HIF-2α可能使ANK表达维持于基础水平，且ANK表达处于基础水平时可起抑制营养不良性钙化的作用，当组织处于退化状态时，ANK表达随着碱性磷酸酶表达水平的增高而增加。由此可见，HIF-1α和HIF-2α可能通过调控ANK表达控制椎间盘基质钙化。
HIF-1α对髓核细胞移植的影响
椎间盘修复即应用组织工程技术将椎间盘种子细胞移植至退变椎间盘中，是目前研究的热点。Risbud等研究认为，在髓核细胞中HIF-1α可能直接与Notch胞内结构域作用并影响细胞发育。HIF-1α调节的信号转导通路可能对细胞再生和替代起重要作用。
Yang等研究认为，在低氧环境下分离、扩增和培养人类退变髓核细胞能更好地保持细胞再生潜能，而常氧条件下分离和扩增会损失髓核细胞部分性能，且后期髓核细胞所丧失的性能在低氧条件下仅部分得到逆转；在低氧条件下分离、扩增和培养髓核细胞可更好地保持髓核细胞细胞特性，如高表达蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和低表达基质金属蛋白酶（MMP）等，并认为人类髓核细胞在低氧环境中表现的特性可能与HIF-1α高表达和HIF-2α低表达相关；在常氧条件下HIF-1α被迅速降解，此条件下分离、培养髓核细胞可导致HIF-2α表达增高，继而引起MMP-2和MMP-13增高；在低氧条件下分离、扩增并培养的髓核细胞在移植后可能具有更好的再生能力；因此建议分离和扩增人类髓核细胞应在低氧环境中进行。
综上所述，在低氧环境中髓核细胞可表达HIF-1α，而HIF-1α参与了髓核细胞增殖与存活、细胞新陈代谢、细胞外基质合成及椎间盘组织钙化等活动，对椎间盘退变进程发展起重要调节作用。对于HIF-1α对髓核细胞增殖及细胞特性的维持，尚需进一步研究，从而为采用髓核细胞移植治疗椎间盘退变提供理论基础。
来源：国际骨科学杂志2015年第36卷第4期
