骨折愈合的过程可以分为血肿形成期、纤维骨痂 期、骨性骨痂期和骨痂重塑期，也可根据组织修复过程将其分为炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。此过程涉及多种炎性因子、肉芽组织、成骨破骨细胞以及生长因 子。由于骨的再生能力很强，一般来说，经过良好复位的骨折经过几个月便可以完全愈合。美国FDA以9个月为期限，将超过9个月骨折端仍未达到骨性连接的临 床现象称为骨不连。从机制上看，骨不连和骨愈合是相反对立的;但就临床治疗方面，骨不连与骨折愈合的治疗目标却又是一致的，即促进断端成骨，达到骨性连 接。目前治疗骨不连较常用的方法仍是手术治疗，随着人们对骨愈合分子机制认识的逐步深入，将来骨不连的临床干预策略也会发生相应变化。
骨愈合发生机制
骨折愈合分为直接愈合和间接愈合。直接愈合需要人为重建骨皮质，将骨折端进行解剖复位和稳定，以重建哈弗氏系统。间接愈合是骨修复的特定过程，包括损伤、炎 症、骨痂形成、骨痂矿化和重塑等过程。具体的骨愈合机制目前尚不清楚，但是近几年已有一些研究证实了许多因素可以影响骨修复过程及预后。
炎症阶段 骨 折后由于破裂的骨血管和骨膜血管出血，形成局部血肿。此时凝血系统激活，血肿内脱颗粒血小板释放强力的血管活性介质。另有一些炎症介质的水平也在受伤数天 后显著提高，包括IL－1，IL－6，IL－11，IL－18和TNF－α等。血管损伤后，局部低氧环境造成骨细胞营养不足并逐渐开始变性坏死。之后，巨 噬细胞进入坏死区并开始吞噬，机体随之释放信号因子如BMP－2，5，7、bFGF、TGF－β、PDGF、IGF等以启动再生阶段。这些因子会促进间充 质干细胞的招募、迁移和增殖，并使它们分化为成血管细胞、成软骨细胞、成纤维细胞和成骨细胞。内皮细胞、成纤维细胞和成骨细胞还可以通过形成肉芽组织来填 补断端缝隙。正常情况下，炎症阶段最长持续一周时间，此时已逐渐产生初始骨痂。
增殖阶段 血 液循环中的成骨细胞和局部骨髓中的单核前体细胞开始吸收坏死骨。此期的特点是骨痂形成，血管长入，类骨质分泌和胶原纤维形成。骨膜反应、血管生成、结缔组 织和纤维骨痂形成也在这一阶段发生，最后被未成熟的编织骨所替代。在低氧环境下，间充质干细胞分化为软骨细胞，成为软骨并稳定骨折带。一些生长因子如 TGF－α2，、PDGF、IGF以及BMP－2，4，5，6等的表达可以刺激软骨的增殖和分化。成骨细胞在骨折端远处开始合成编织骨组织，而软骨内骨可 以直接在骨折局部形成，但是较不稳定。TGF－β2、β3，BMPs和其他信号诱导软骨痂逐渐钙化，最终形成编织骨。
重塑阶段 重 塑阶段包括形成骨痂和矿化以及结构重塑。这一过程也可被认为是继发性骨形成，包括将不规则的编织骨转变为板层骨。在这一阶段，成骨细胞逐渐吸收新生成的编 织骨并以板层骨取代。破骨细胞逐渐极化，并粘附到表面，继续重塑过程。它们形成封闭皱褶缘，蛋白酶进入吸收区域，破骨细胞在Howship陷窝中开始吸收 骨组织，以便成骨细胞可以沉积在新生骨表面。这一连续过程同正常骨的代替修复机制有些相似；但是在骨密质与骨松质内仍是不同的。在骨松质内，细胞会在血管 附近，骨沉积的过程会在骨小梁表面进行，这一过程被称为“爬行替代”。重塑过程被一些促炎信号所调节，如IL－1，6，11以及升高的 TNF－α，IL－12和IFN－γ。此外，生长激素和甲状旁腺激素同样在这一阶段加速、加强了愈合进程和骨痂强度。电生理也影响着骨重塑。当压力作用 时，骨表面出现正电荷，这与破骨活性有关，而负电荷与成骨活性有关。
骨不连的发生及其治疗方法
临床上骨不连发生多与创伤后感染及骨缺损有关，且局部血供不足、不恰当的内固定治疗、频繁错误的手法复位等因素也会增高发生骨不连的概率。根据其临床表现、X线表现及是否感染等因素，一般可将骨不连分为:肥大性骨不连、萎缩性骨不连、感染性骨不连及无菌性骨不连。
手术治疗 骨 不连的手术治疗方法有很多种类型，包括闭合髓内钉、内固定钢板、外固定支架、骨移植及各类方法的综合应用。每一种手术方式都有各自特点，如闭合髓内钉比较 适合于无菌性长骨骨不连;外固定支架尤其是Ilizarov外固定支架是治疗感染性长骨骨不连的有效固定方法;内固定钢板治疗骨不连有多种方法，目前主要 包括动力加压钢板和锁定加压钢板;骨移植是近来治疗骨不连最普遍的方法，包括自体骨移植、带血管蒂骨瓣移植、吻合血管的骨移植等。
非手术治疗 骨 不连的非手术治疗方法主要包括物理治疗、分子生物治疗和中医中药治疗。物理治疗可以分为体外冲击波疗法、电磁脉冲疗法及低频脉冲超声疗法等;分子生物治疗 则有自体骨髓移植、骨形成蛋白疗法、骨髓间充质干细胞疗法、脱钙骨基质等方法;除此之外，中医中药一直在我国有着十分重要的地位，结合西方技术，中西结 合，也能起到积极的治疗效果。非手术治疗最好的优点是无需再一次经历手术以及手术过程中带来的损伤。而其缺点也同样明显:缺乏稳定的紧密固定。
然而，无论是手术治疗还是非手术治疗，仍有部分顽固性骨不连患者始终无法治愈，给患者及其家庭带来了极重的负担。目前随着再生医学的飞速发展及干细胞技术的不断成熟，利用干细胞再生能力的细胞疗法治疗甚至治愈顽固性骨不连似乎能够逐步实现。
细胞疗法治疗骨不连及其应用前景
间充质干细胞分化机制及信号通路 间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属多能干细胞，在特定的体内外诱导环境下，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及成肌细胞等多种组织细胞。
Wnt/β－catenin 经典信号通路Wnt，即无翼型MMTV整合位点，是一类分泌型糖蛋白。在Wnt信号的作用下，MSC分化成为成骨细胞。Wnt首先和FZD以及 LRP5/LRP6结合，引起细胞内信号激活，使得原本负责磷酸化并降解β－catenin的GSK3β失活，细胞内β－catenin不断积聚，最终转 入到细胞核内，与TCF/LEF转录因子结合，并启动靶基因转录RUNX2等，以此调控MSC向前体成骨细胞分化并逐渐成熟为成骨细胞。
TGF－β 信号通路转化生长因子家族可以调控细胞分化、增殖、迁移和凋亡等过程。Smads蛋白被TβF－Ⅰ激活后在细胞浆内聚集并入核，结合DNA并启动靶基因转 录或与其他转录因子协同作用，促进MSC向成骨细胞分化。骨诱导因子BMPs则可以通过Smads增强ALP的活性。
MAPK信号通路由ERK通路、p38通路、JNK通路等组成。目前已知细胞外基质与膜受体结合后磷酸化，并招募鸟核苷酸交换因子，使GTP替代Ras上的GDP，MAPK进而进入细胞核并启动一系列生物效应，对MSC向成骨分化起诱导、调节作用。
MSC治疗骨不连 应 用MSC治疗骨折愈合的历史最早可以追溯到1869年，Gougeon首先在家兔身上研究骨髓的成骨功能，之后有人通过同种异体移植、异种移植、替代疗法 等方式试图提高其成骨能力。Burwell在1985年发现骨移植治疗中的原始骨髓成骨细胞发挥着其中大部分的功效。如今，MSC用来形容来源于骨和相关 组织的具有粘附能力的类成纤维增殖细胞群，并具有在正常骨组织中分化为一种或多种细胞型的能力。
Hernigou等发现骨不连患者身上骨髓内祖细胞的数量在体外克隆后显著少于正常患者，且这一现象常出现在感染、组织缺损严重、多次创伤及缺乏血供的骨折损伤处，这与临床上发生骨不连的高危因素相一致，高度提示骨不连的发生机制可能与此有关。
Y.Homma 等通过骨髓吸引术和细胞收集对患者进行MSC骨内注射，发现经皮注射的自体骨髓移植是治疗非感染性萎缩性骨不连安全有效的方法。尽管这种纤维组织形成骨痂 过程的具体机制目前并不清楚，但确实提供了成骨所需的前体细胞和血管形成的细胞因子，通过表达内皮细胞前体促进血管形成，此外，内皮细胞的增殖增加了前体 细胞的迁移和分化，并生成周细胞和血管壁细胞以稳定新生血管的生长。
DonatellaGranchi 等对10例先天性胫骨假关节(CPT)患者(其中6例尚伴有Ⅰ型神经纤维瘤病(NF1))使用自身髂嵴内的MSC，富血小板纤维蛋白和骨移植疗法。在经过 生化、功能及分子检测后，发现CPT伴NF1的患者中有3例有骨整合现象。并且，经体外培养发现，多数患者的MSC在自体血清的环境下可以出现矿化结节， 只有少数矿化能力完全破坏的患者预后较差。
富血小板血浆(PRP)的应用 近 年来，PRP疗法正逐渐应用于骨关节疾病、整形外科手术等领域并受到了越来越多的关注。PRP通过提供组织修复过程需要的生物活性因子如TGF－β、 PDGF、PF4、IL－1、IGF、骨钙素、骨连接蛋白、纤维连接蛋白及纤维蛋白原等改善局部微环境，加速组织修复，减少术后感染机会。这些特性为临床 上促进骨愈合和治疗骨不连提供了另一种选择。
Dallari 等评估了三组胫骨截骨术患者术后的骨巩固情况(A组:冷冻骨库移植+PRP凝胶;B组:冷冻骨库移植+PRP凝胶+BMSC;C组:冷冻骨库移植)，结果 发现，A组和B组患者表现出了更好的移植骨整合能力，但是它们并没有显著改变患者的功能性结果。Murphy等比较了脐带PRP、成人PRP和牛胎血清 (FBS)对MSC迁移能力的影响，结果提示PRP能更有效地促进细胞迁移能力。
ZouJ 等通过体外培养兔BMSC发现相比于对照组，PRP组有着显著增强的AKP染色和矿化结节，同时，AKP活性和成骨标志性mRNA(骨钙素和骨调素)在 PRP组持续增高，提示PRP可以提高MSC的增殖和成骨分化能力。而TavakolinejadS等取成人脂肪干细胞(hADSC)，用人 PRP(hPRP)培养与FBS培养及阴性对照进行对比，结果发现PRP显著提高了细胞的增殖能力，且15%的hPRP比10%的hPRP效果更佳，尽管 hPRP组hADSC的成骨分化能力并不如FBS组，但是仍高于阴性对照组。
目前已经有临床研究在骨科损伤中使用PRP疗法，且有着不错的效果，尽管有研究证实PRP具有促进MSC的迁移和分化能力，但是至今在临床应用中仍缺乏足够的证据，以至于不能定下最终的决定性结论。
组织工程学应用于骨不连修复
组织工程学修复缺损组织的基本原理是体外扩增组织细胞，接种到另一生物材料上并将此复合物植入缺损部位，在生物材料被不断吸收的过程中，种子细胞形成新的组织，以达到修补缺损部位的目的。因此，生物材料和种子细胞的选择成为了这一过程的关键。
近年来，3D打印技术的发展使其成为了骨组织支架的一种新选择。Tamjid等通过在支架表面修饰TiO2和生物活性玻璃等纳米颗粒模拟细胞外基质 (ECM)结构，以此调控成骨前体细胞的一些性质如粘附性、增殖能力等，并通过二维平片和三维结构来评价组织生长和相关酶的活性。微粒体光刻成形 (MSTL)技术通过选择性固化不同层面平台上的光聚合物能够创造任意的3D结构，它不仅可以有高分辨率，更有着极快的制造速度，且已在组织工程学中应用 广泛。LeeJW等将BMP－2嵌入L－MSTL中，发现其在体外能有效促进细胞分化，并在大鼠颅骨损伤修复模型中展示出比未修饰支架和由粒子沥滤/气体 发泡法制造的支架更好的修复效果。
尽管3D技术目前仍属于起步阶段，但现在一些计算机辅助纳米级设计的拟ECM已经证实有潜力制造出能改善骨组织微环境的生物材料，这使得3D技术在将来有很大的应用前景。随着覆盖生物制剂的植入性仿生材料的不断进步，组织工程学将可以提供越来越大的帮助。
总结
综上所述，除了手术治疗骨不连之外，随着人们对骨愈合机制理解得不断加深，细胞疗法的应用价值将会不断显现，同时，治疗骨折及骨不连的临床策略也会随之改变。结合组织工程学等其他学科优势，实现骨折及骨不连的个体化治疗将会成为未来的一大趋势。
