炎症、外伤、肿瘤切除所致大面积骨缺损修复是临床难题，随着组织工程技术的发展，组织工程骨为骨缺损修复提供了新方法。组织工程骨的微血管化是骨组织工程研究的核心问题[1]。目前可通过加入促血管生成因子、改造支架结构等方法促进组织工程骨血管形成[2]，但效果并不理想。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在体内外可分化为血管内皮细胞生成血管，且在特定微环境下可促进MSCs成骨[3]。因此，本研究拟将自体外周血来源的EPCs与BMSCs直接共培养，体外复合至包被纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）的部分脱蛋白生物骨（partially deproteinised bone，PDPB）支架上，并异位移植至兔四肢肌袋内，观察EPCs微血管化能力，旨在探讨EPCs在BMSCs成骨中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大耳兔9只，体质量（2.5±0.5）kg，购自昆明医科大学动物科。
PDPB由本课题组自制[4]。H-DMEM培养基、L-DMEM培养基、15%FBS（HyClone公司，美国）；兔淋巴细胞分离液（Sigma公司，美国）；胰蛋白酶、Trizol（Takara公司，日本）；兔CD34、CD133、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、CD29、CD90、CD105、紧密连接蛋白1（zonula occludens protein 1，ZO-1）一抗（北京博奥森生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；荧光定量PCR试剂盒及引物设计（大连宝生物工程有限公司）；Loading Buffer、DNA ladder（Fermantas公司，立陶宛）。细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；低温离心机（北京医用离心机厂）；RT-PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；光学显微镜、倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Leica Qwin 2.3软件（Leica公司，德国）；Image-Pro plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 外周血EPCs及BMSCs共培养体系的建立
1.2.1 外周血EPCs分离培养及鉴定全身肝素化后抽取1～9号新西兰大耳兔耳中央动脉外周血5 mL，采用兔淋巴细胞分离液分离单核细胞，密度梯度离心法及贴壁法分离EPCs[5]，同时标记第1～9号兔细胞；原代细胞生长至70%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取第3代细胞行免疫荧光染色观察CD34、CD133、vWF表达，DAPI染核，甘油封片，荧光显微镜下观察。
1.2.2BMSCs分离培养及鉴定抽取第1～9号新西兰大耳兔双侧胫骨、股骨肝素抗凝骨髓血5 mL，采用密度梯度离心法及贴壁法分离BMSCs[5]，同时标记第1～9号兔细胞。原代细胞生长至70%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶ 2比例传代。取第3代细胞行免疫荧光染色观察CD29、CD34、CD90表达，DAPI染核，甘油封片，荧光显微镜下观察。
1.2.3 外周血EPCs及BMSCs共培养体系建立将第3代1 ～ 9号兔BMSCs加入成骨诱导分化培养基[6]（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/ mL链霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的H-DMEM培养液），2 d换液1次。诱导7 d后，均收集1.106个细胞，加入0.5.106个相同序号的第3代EPCs，即BMSCs ∶ EPCs=2 ∶ 1[5]，加入前述成骨诱导分化培养基及成血管诱导分化培养基[7]（含10%FBS、50 ng/ mL VEGF及20 μg/ mL牛脑垂体提取物的甲基纤维素半固体基础培养基）各半进行培养，即为1 ～ 9号外周血EPCs及BMSCs共培养体系。
1.3 组织工程骨构建
1.3.1 生物支架准备生物支架为本课题组预先制备的包被FN的PDPB[4]，大小为0.5 cm.0.5 cm.0.3 cm，于4℃冰箱储存备用。
1.3.2 组织工程骨构建分别制备3种复合不同细胞的组织工程骨。取出54 块PDPB，置于装有DMEM的培养皿中预湿；于培养皿中分别加入混有20 μL PBS的1 ～ 9号兔来源的单纯EPCs、单纯BM SCs及共培养细胞各1.106个，分别构建A、B、C 3种组织工程骨（n=18）。于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养4 h后，分别置于96孔板，C组加成骨及成血管诱导分化混合培养基，A、B组加成骨诱导分化培养基至总量100 μL，置37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，隔日换液。
1.4 动物体内移植实验
1.4.1 组织工程骨兔自体异位移植取1 ～ 9号新西兰大耳兔，水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，分别于右上肢、左上肢、右下肢剃毛、消毒，皮肤、皮下分层切开，切开肌膜，钝性分离肌肉束，扩充1 cm.1 cm.1 cm大小的肌袋。组织工程骨体外复合培养4 d后，分别将1 ～ 9号兔来源的A、B、C 3种组织工程骨移植至同序号兔右上肢、左上肢、右下肢肌袋[8]，每个肢体移植2 块组织工程骨。
1.4.2 大体观察移植后2、4、8 周，随机取3只兔，切开术区观察各组组织工程骨生长情况。
1.4.3 组织学及免疫组织化学染色观察大体观察后取各组组织工程骨，于4%多聚甲醛固定，脱钙液脱钙、石蜡包埋组织切片，中心部分连续切片3张，片厚0.5 μm。常规行HE 染色及CD34、CD105、ZO-1免疫组织化学染色，光镜下观察。每张HE 染色切片随机取3 个视野，采用Leica Qwin 2.3软件分析成骨面积，按以下公式计算骨长入率：（骨长入区域面积/植入物区域面积）.100%；采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析免疫组织化学染色切片，得到阳性细胞平均吸光度（A）值，比较各组CD34、CD105、ZO-1表达量变化。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较及组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 外周血EPCs、BMSCs形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，外周血EPCs培养14d呈典型“铺路石”样外观，21d细胞连接成片。第3代细胞CD34、CD133、vWF免疫荧光染色均为阳性。见图1。BMSCs培养7 d形成小型细胞集落；9 d细胞集落数目增多，双核、梭形、纺锤形细胞螺旋状聚拢。第3代BMSCs免疫荧光染色CD29、CD90呈阳性，CD34呈阴性。见图2。
2.2 动物体内移植实验
2.2.1 大体观察移植后2周，各组组织工程骨均被周围软组织包绕，C组较A、B 组包绕紧密，局部不可分开；切开后各组切缘锐利，切面均可见组织工程骨原有孔隙，C组切面边缘见少许鲜红软组织长入。4周，各组包绕组织工程骨的软组织增多、增厚，C组切缘见鲜红软组织进一步向孔隙内填充，B组长入组织工程骨内鲜红软组织较少，A组更少，各组均未见明确血管长入组织工程骨内。8周，各组周围软组织与组织工程骨分界不清，组织工程骨边缘圆润；C组切面大部分组织工程骨原有孔隙由鲜红软组织填充，可见迂曲小血管网长入组织工程骨中心，A、B组组织工程骨中心仍有未被填充的原有孔隙。见图3。
2.2.2 组织学观察移植后2周，各组组织工程骨内均见少量血管，管腔形成不明显，未见明显骨组织长入。4周，各组组织工程骨内毛细血管逐渐形成管腔，A、C组较明显；B、C组可见胶原纤维生长，C组更明显。8周，各组可见毛细血管明显增多，管腔内出现红细胞，胶原纤维增多，可见骨小梁和新生骨，以C组明显，其次为B组。见图4。移植后4、8周，C组骨长入率显著高于A、B组，B组高于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2.3 免疫组织化学染色观察移植后2、4、8周，随时间延长，3组组织工程骨CD34、CD105、ZO-1表达量均逐渐增多，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。组间比较：移植后2周，A、C组见少许阳性细胞，B组未见阳性细__胞；仅CD105表达量3组间两两比较差异有统计学意义（F=9.854，P=0.000）；4、8周，3组间CD34、CD105、ZO-1表达量两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），C组最多，B组最少。4周，A、C组新生内皮细胞逐渐围成管腔形成新生血管，少量管腔内可见红细胞，B组管腔形成不明显；8周，C组见明显新生血管管腔且部分与宿主血管沟通，A组新生血管增多，B组少许新生血管。见图5。
3 讨论
组织工程支架上的种子细胞只有在有氧代谢、细胞灌注充足、合理营养物质供应和代谢产物及时排出时才能存活[9-10]；然而，种子细胞与支架材料复合移植后，周围宿主血管内营养物质的扩散深度仅约150 μm/h[11]。因此，寻找有效方法及时建立组织工程骨与宿主之间的有效血液循环，保证干细胞有持续营养物质供应，是干细胞存活的关键。
Martin等[10]将EPCs和BMSCs采用Transwell小室间接共培养及两种细胞直接接触共培养进行比较，结果显示直接接触共培养的两种细胞成骨更明显，认为可能由于两种细胞的直接接触改变了共培养环境，促进了两种细胞之间的信号交流及生长因子分泌，从而促进了成骨。因此，本研究采用直接接触共培养方法，将按1 ∶ 2比例共培养的自体外周血来源EPCs-BMSCs及单纯培养的EPCs、BMSCs分别复合于PDPB上，同时自体移植至兔四肢肌袋内行异位体内诱导成骨培养，观察组织工程骨及周围组织的变化。移植8周后，3组组织工程骨支架均未出现排斥反应，且逐步降解，由胶原、骨小梁及新生骨替代。其中C组组织工程骨成血管及成骨趋势最好，随时间延长至8 周时骨长入率为1.47%±0.21%，明显高于其余两组，与文献报道一致[12]。免疫组织化学染色观察示，移植后8周C组组织工程骨内新生血管明显增多，且部分与宿主血管沟通，见大量表达CD34、CD105、ZO-1的血管内皮细胞，C组各因子表达量均显著高于A、B组。
本研究结果显示，将EPCs与BMSCs按1∶2比例共培养具有协同作用，促进了组织工程骨微血管化进程，增强了BMSCs的成骨活性，与国外研究结果一致[13]。BMSCs有高度自我更新及多向分化潜能，在体内外不同微环境下均可诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞和破骨细胞[14]，其在成骨过程中旁分泌多种可溶性细胞因子，如VEGF、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G- CSF）、BMP-2等，其中VEGF可与EPCs上的VEGF受体特异性结合，活化受体细胞内段偶联的络氨酸激酶，催化下游信号蛋白，促使EPCs增殖并定向内皮细胞分化，促进新生血管管腔形成[15]，因此VEGF是EPCs促进血管生成的最重要因子[16]。G-CSF可通过提高VEGF表达，提高外周血EPCs增殖能力及归巢能力[17]。BMP-2可由BMSCs分泌，亦是EPCs分泌的重要生长因子[18]，可在移植后15 min内促进MSCs成骨分化[19]。而EPCs可明显提高BMSCs的干性功能、增殖能力及成骨分化能力，温丽[20]研究表明在EPCs旁分泌因子的作用下，EPCs还可提高BMSCs分泌VEGF及BMP-2等成骨、成血管因子，从而促进新生血管形成及新骨形成。
本研究采用免疫组织化学染色检测了各组组织工程骨中CD34、CD105、ZO-1阳性细胞的表达，结果显示C组组织工程骨移植后4周即形成了血管管腔结构，并逐渐与周围软组织内血管沟通，形成功能性微血管（ZO-1阳性），促进了营养物质输送，增加BMSCs存活数量，提高其增殖和成骨分化能力。CD34是血管内皮细胞特异性的标记物，能突出显示较小的不成熟微血管和单个内皮细胞，但成熟的血管内皮细胞CD34也可表现为阳性；CD105是新生血管特异性标记物，能突出显示新生血管，在研究肿瘤、组织工程移植物时广泛应用；ZO-1是紧密连接蛋白，其表达表示血管为功能性血管，同时可见血管内红细胞，ZO-1与CD105同时表达即可认为新生血管为功能性血管，具有携带营养物质并带走代谢产物的功能[21]。本研究结果显示，移植2周时3组间ZO-1表达量比较差异均无统计学意义，说明此时3组均未生成功能性微血管，而移植后4、8周，C组ZO-1表达量较其余两组均明显增加，生成了功能性微血管。
综上述，将EPCs与BMSCs联合培养可增加组织工程骨微血管网的形成及促进成骨，为自体细胞复合构建血管化组织工程骨提供了理论依据。但这两种细胞相互作用的确切分子机制尚未完全明确，有待于进一步研究。
